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一鸣惊人的中国科学家发明世界一流新技术

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撰文 | 陈晓雪 王承志 程莉

责编 | 李晓明

今年 5 月 2 日,韩春雨与合作者的文章终于发表了——先被《科学》(Science)审稿小半年后拒稿,后历时 9 个月终被《自然生物技术》(Nature Biotechnology)接收。

接下来的几天里,他每天都要收到几十封、甚至上百封来自同行的邮件,但并不是每封都能及时回复。

" 因为实验室人手有限,处理不过来那么多邮件,还望同行海涵。"《知识分子》第一时间联系上了韩春雨,电话那端的他满是歉意。

而此刻,新的基因编辑技术引起国内同行的热切关注,人们纷纷追问:" 谁是韩春雨?"

 

论文在线发表截图 01

 

更精确,效率更高

今年 42 岁的韩春雨是河北科技大学的一名副教授,因为这篇新发表的工作 " 一鸣惊人 "。

简单地说,韩春雨团队发明了一种新的基因编辑技术(NgAgo-gDNA),适合在人类细胞中基因组编辑,不同于已有最时兴的技术(CRISPR-Cas9)。后者通过 RNA 寻找替换序列,而新技术通过 DNA 作为介导寻找替换目标。

NgAgo 是 Natronobacterium gregoryi Argonaute 这一短语的简称。韩春雨团队就是利用格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的 Argonaute 实现了 DNA 引导的基因组编辑,并发现 NgAgo 作为一种 DNA 介导的核酸内切酶,适合在人体细胞中进行基因组编辑。

Argonaute 作为一个核酸内切酶家族,最早由荷兰瓦赫宁恩大学(Wageningen University) 的约翰 – 范德欧斯特(John van der Oost)研究组证明这一家族的同源蛋白酶活,可以有效地利用单链脱氧核糖核酸作为短介质,去相对精准地切割基因组靶点。

范德欧斯特的这一发现开启了基因组工程的一个新篇章,因为之前的大多数基因组工程研究是基于 RNA 的(CRISPR-Cas9、TALEN 等,锌指蛋白是基于 DNA 的但是没有实现可编码的优势),哈佛大学分子与细胞生物系副研究员段昕认为," 这一进展给大家引入了一个新的思路去进一步改造 "。

目前世界各个实验室最为流行的基因编辑工具是 CRISPR-Cas9。从原理上来说,早期的 DNA 编辑技术是通过蛋白(如锌指蛋白)来寻找需要替换的序列,而 Cas9 则是通过 RNA(引导 RNA,即 gRNA)来寻找替换的序列,由于比操作蛋白质简单得多,Cas9 技术得以迅速被广泛使用。

但是,Cas9 需要 19 个配对的碱基,并且要求在需要编辑的基因组上这 19 个碱基后面必须紧邻一个符合一定特征的三碱基序列(PAM 序列),这在一定程度上限制了 gRNA 的设计,而 NgAgo – gDNA 系统不需要 PAM 序列,拓宽了其设计范围。

NgAgo 结合 24 个碱基的 gDNA,这比 Cas9 的 gRNA(19 个碱基)要长 5 个碱基,理论上其精确性要提高 1024(4 的 5 次方)倍。DNA 编辑相当于在一本书中的某个位置找到一个单词将它替换成另一个单词,并且要保证书中其它地方的单词不被替换。显而易见,如果替换的是 the 这样的简单单词,那么可能从书中找到多个地方,而找 pneumonoultramicroscopicsilicovolcanoconiosi 这样的单词则不太可能找错。

韩春雨团队的研究还发现,NgAgo – gDNA 系统对向导序列 – 靶序列错配容忍度很低。gDNA 上任何一个碱基的变换都会降低 NgAgo 的切割效率,如有三个错配则使其完全失活。这在另外一个机制上提高了 NgAgo 使用的精确性,特别是一些富含 GC 序列的地方,NgAgo 系统比 Cas9 系统效率更高。

NgAgo 的 gDNA 需要 5 ’端磷酸化的单链 DNA (5p-ssDNA),这种形式的 DNA 在哺乳动物细胞中几乎不存在,这保证了 NgAgo 不会被内源的 DNA 序列错误带到不该去的地方。该系统的另外一个优点是 5p-ssDNA 是外源转化进细胞的,其时间和浓度可以非常精确地控制。而 Cas9 系统的 gRNA 是内源表达的质粒,难以精确地控制。

韩春雨团队在论文中还介绍,与 Cas9 相似,Argonautes 在基因表达抑制及抵御外源核酸中起关键作用。但是,Argonautes 在许多方面不同于 Cas9。比如,Cas9 只存在于原核生物中,而 Argonautes 在进化过程中保守,存在于几乎所有生物体中;尽管大多数的 Argonautes 结合单链(ss)RNAs,在 RNA 沉默中起重要作用,一些 Argonautes 却可以结合 ssDNAs 并切割靶 DNA;正确的 Cas9 结合要求向导 RNA 必须有一个 3′RNA-RNA 杂化结构,而 Argonaute 结合则不要求特异的一致的向导 RNA 二级结构;Cas9 只可以切割 PAM 上游的靶序列,而 Argonaute 不要求靶序列上存在特异的序列。当 Argonaute 与向导序列结合时,它们可以影响彼此的生物化学特性,并作为一个整体起作用。

" 因此,从理论上说,NgAgo 的脱靶率更低 ",韩春雨告诉《知识分子》。

 

韩春雨(中)及其合作者沈啸(左)、高峰(右) 02

 

" 幸好 NgAgo 足够给力 "

1974 年出生的韩春雨是石家庄人,他本科毕业于河北师范大学,这是一所位于石家庄的高校,也是他父母任教的地方。

1995 年,韩春雨来到北京,先是在中国农业科学院攻读硕士学位,后在中国协和医科大学(中国医学科学院)接受博士研究生训练,2003 年获得博士学位。此后的他,并没有寻找教职,而是在协和的实验室继续一项关于 " 人类 Bex2 与 LMO2 相互作用、调节新型 DNA 结合复合物的转录活性 " 的研究,2005 年该结果发表在《核酸研究》(Nucleic Acids Research),韩春雨为第一作者,这篇文章也成为他科研生涯中具有标志性的成果。

 

韩春雨 2006 年,32 岁的韩春雨离开北京,回到了石家庄,在河北科技大学担任教职。十年后,韩春雨发表了他独立研究生涯以来最为重要的工作。

 

韩春雨的研究方向是真核基因表达调控,特别是和肿瘤相关的基因,以及表观遗传相关蛋白,RNA 的功能研究,例如,长非编码 RNA 的功能及其他。近些年基因编辑技术,尤其是 CRISPR-Cas9 的不断完善,深刻地影响到整个生命科学领域,韩春雨的实验室也用上了 CRISPR-Cas9 这一工具,他本人也一直在关注基因编辑领域的进展,有过一些想法,但并没有下决心动手。

促使韩春雨真正动手的是 2014 年年初的两篇文献,其中一篇是范德欧斯特研究组发表在《自然》(Nature)杂志的关于 "DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute"。这篇研究显示,TtAgo(Thermus thermophilus Argonaute)能以 DNA 为模板切 DNA。段昕介绍,范德欧斯特工作的局限性在于他们实验所需要的温度在 65-75 摄氏度,这使得很多实验不能在生理条件(哺乳动物在 37 摄氏度左右)下完成。

当时,北京大学的一位研究员得知范德欧斯特的研究后非常兴奋。他判断,TtAgo 可以发展为一个更简单的基因编辑工具,并产生了一个想法:哺乳动物中是否在特定时期或特定细胞中存在类似现象,比如决定细胞分化或抗体形成的过程。不过,他的实验室在合成了人源密码子优化的 TtAGO 后,尝试了几次切 GFP 序列,却以失败告终。

几乎在同一时间,韩春雨的实验室进展则十分顺利," 大概是两个月就有结果出来了 "。

段昕介绍说,韩春雨团队做的,就是进一步搜寻 Argonaute 的同源蛋白。幸运的是,大量的已知大型测序数据给了他们很多有效的帮助,找到并进一步证明了来自不同菌株格氏嗜盐碱杆菌的 Argonaute 同源蛋白可以在生理条件下实现类似的功能。" 韩的工作把系统进一步优化,而且使得短介导 DNA 的准确性和识别长度有了重大突破。" 段昕说。

北京大学生命科学学院研究员魏文胜课题组也想尝试 DNA 介导的 Argonaute,但 TtAGO 的特点是工作温度比较高。" 这篇文章比较聪明,还是走对了路,没有研究如何使高温才能工作的酶通过构象改变达到降温,而是找到这样一株可以在 37 度工作的 Argonaute。" 魏文胜告诉《知识分子》。

之后,韩春雨一边向《科学》杂志投稿,一边和实验室的几个学生一起完善结果。他说,当时文章最主要的结果是 NgAgo 确实可以做基因编辑工具,但 " 审稿人要求的比较完美 ",来回审了小半年之后," 最后被拒了 "。

2014 年秋天,韩春雨跟沈啸提起自己正在做的 NgAgo 的工作,提出了几个候选的工具。" 这么好的课题和想法,我当然全力支持并加入了 ",沈啸向《知识分子》回忆道。

沈啸是浙江大学医学院基础医学系研究员,此前他在中国协和医科大学博士毕业前一年,与韩春雨合作了发表在《核酸研究》的论文。2003 年博士毕业以后,沈啸在美国 Emory 大学从事博士后研究,2008 年开始担任美国 Cedars-Si

nai Medical Center 的研究员科学家,2013 年被聘为助理教授,2015 年入选浙江大学 " 百人计划 "。

在被《科学》拒稿后,韩春雨和实验室的学生继续补充实验,而沈啸在项目和实验设计上提供建议,他们发现了更多关于 NgAgo 的特性。

" 幸好 NgAgo 也比较给力,发现它是 one-guide faithful 的。" 韩春雨笑着说。

2015 年 6 月 3 日,这篇仅有五人署名的文章的被投往《自然生物技术》,9 个月之后,文章被接收,今年 5 月 2 日在线发表。

03

" 文章发出来是好事,也是坏事 "

在整个生物界唯强大的 CRISPR-Cas9 马首是瞻的时代,韩春雨的这一发现引发了诸多媒体和同行的热情关注。

有评论认为,"(如果)未来中国任何一所普通的科研院校都能出现这种激动人心的科研成果,那么中国的科研实力才是真正的达到世界领先水平 "。

国内关注生物行业的媒体评价说," 该成果核心为一项替代目前通用的 Cas9 的基因组编辑新技术,这一成果打破了国际基因编辑技术的垄断 "。

韩春雨表示对此评价不敢苟同,他认为,NgAgo – gDNA 系统和 Cas9 都为基因编辑应用提供了更好的工具和多样化的选择,各有各的用处。

沈啸向《知识分子》表示,他对 NgAgo 可以取代 Cas9 的评价持谨慎态度," 最客观的说法是找到了新的基因编辑工具 "。

沈啸说,Cas9 基因编辑系统有点复杂,每当把它某一个劣势用某种技巧修正后,使之特性更高、更有效,就会是一篇很好的论文,每进行一个改良,就是一篇 CNS 的论文。" 大部分人包括一些科学家可能自然而然受一种权威的影响,Cas9 太强大了,大家都把目光集中在 Cas9 上,想怎么磨这把刀,把它做得更好更漂亮。"

正是因为 Cas9 太热,很多人就忽视了去寻找更好的甚至先天就可以规避这些问题的工具。前述北京大学的研究员告诉《知识分子》,2014 年的时候,他们也在做 TtAGO 的实验,但部分因为依赖 Cas9 而放弃继续研究 Argonaute 。" 学生觉得不太靠谱,而实验室里其他人 Cas9 用得十分熟练,都觉得没有必要再换了,我也没有坚持," 他不无遗憾地说。

韩春雨团队的工作已经证实了一个新的、有自己特点和优势的基因编辑工具,但是如何利用它,找到它更多的特性,还有很多工作要做。

" 我和韩春雨现在是非常非常急迫的心理,文章发出来是好事也是坏事,好事是这项工作让大家知道了,坏事是大范围的竞争,我们的工作是不是能赶上趟,继续做下去,是不是我们中国的科学家还能继续报道它," 沈啸说,国外的很多实验室设备条件非常强," 我们没法比,他们一上来做的话,很多东西会很快出结果。"

04

石家庄的四人实验室

无论是在微信圈还是海外华人的论坛,人们不约而同地将韩春雨和麻省理工学院博德研究所的核心研究员张锋联系起来。1981 年出生的张锋同样来自石家庄,他以在基因编辑领域的诸多贡献而被人们所熟知,包括首次报告了 CRISPR-Cas9 在哺乳动物体基因组编辑中的应用,找到更小的 Cpf1 蛋白来替代 Cas9 酶。

与韩春雨一直在国内接受科学训练、从事研究不同,张锋有海外学习的背景,更有在知名实验室研究的经历。11 岁那年,张锋随母亲到美国爱荷华州的得梅因定居,高中时就在一个基因治疗实验室实习,全奖进入哈佛大学学习化学和物理学,期间跟随知名华人科学家庄小威做过研究,后来到光遗传学主要发明人之一卡尔 · 戴瑟罗特(Karl Deisseroth)在斯坦福大学的实验室,参与到光遗传学发明的部分工作。在哈佛大学短暂地停留之后,张锋受聘于博德研究所,一个科研经费和研究人员都可以在美国排到前列的研究机构。

而在河北科技大学生物科学与工程学院的实验室," 离心机是‘飞鸽’牌,与国内自行车品牌相同,从 0 加速到 12000 转大概需要 1 分钟的时间," 韩春雨不无幽默地说。

直到今天,韩春雨所在的的生物科学与工程学院还没有博士点,韩春雨实验室的学生都是硕士研究生。理论上,韩春雨每年可以招五六个硕士研究生,但是真正能够跟他一起专注科研的,也只有一两个人。

包括《自然生物技术》的这篇论文,跟韩春雨一起做实验的一共三个人,其中第一作者高峰两年前就从河北科技大学硕士毕业,那时 NgAgo 的主要结果刚刚做出来,高峰没去找工作,也没有申请博士,而是留在导师韩春雨的实验室继续工作,为了省钱,甚至睡觉都在实验室。这一情景与韩春雨当年博士毕业后留在协和继续未完成的科研工作有着惊人的相似。

" 韩实验室的工作是很了不起的," 北京大学生命科学学院饶毅实验室研究生张翼评论说," 他们唯一的生物信息学工具可能是 NCBI-psiBLAST,他们的 Argonaute 都是从菌种库买来的菌里面克隆出来,根本没有花钱合成基因。" 即使是在这么艰难的工作环境下,他们不仅找到了 NBT 文章中报道的 NgAgo,还找到了(他们专利里报道的)一大堆别的 Ago,都具有在低温(10-50 摄氏度)下结合 5p-ssDNA,造成靶 DNA 双链断裂的能力。

很多人对韩春雨能够在如此简陋的环境下取得开创性的工作感到惊讶,但是他的大学同学、河北师范大学特聘教授徐小冬告诉《知识分子》,她对韩春雨能够做出现在的工作一点也不感到奇怪,虽然韩春雨没有海外留学经历,但是也受到了很好的专业科学训练,她认为,对一个受过专业科学训练的科研工作者来说,占用资源的多少并不会决定他是否能够做出很好的工作。

" 他这个人蛮有个性,从来不是那种循规蹈矩的人,他能够坚持一些东西,守着自己的一亩三分地,也敢于表达自己,挑战威权 …… 投稿能够较这么长时间的劲,说明对自己的工作很有自信。" 徐小冬说。

如今,面临四面八方涌来的合作邀请,韩春雨统统交给沈啸来处理。" 他见识广,也是一个好的合作者 …… 我主要在实验室干活,而且我也喜欢这样的生活。" 韩春雨说。

北京大学生命科学学院张翼:

" 还有多少有潜力的中国科研工作者没有被支持?"

近年来,Type II CRISPR 系统(以 SpCas9 为代表)的应用在分子生物学和生物工程中产生了巨大影响。科学界仍然在寻找和发展更灵活可用的 CRISPR 衍生系统,例如能造成更复杂的核酸替换(dCas9-AID),核酸单链剪切(dCas9 nickase)和粘性末端剪切(Type V CRISPR, CpfI)的 CRISPR 衍生工具。同时由于 CRISPR 系统的种种技术和商业上的局限性,科学界也在寻找其它可用的类似核酸酶系统。

韩春雨等的工作,是在 2014 年和 2015 年 John van der Oost 组的研究基础上更进了一步。van der Oost 是一位微生物专家,他参与了 CRISPR 系统机理的最早研究,也参与了 Type V CRISPR 系统的发现。2014 年,van der Oost 组首先报道嗜热细菌 T.thermophilus 的 Ago(TtAgo)具有在 5 ’磷酸化小 DNA 片段(guide ssDNA)引导下切割靶 DNA 的能力。2015 年,他的实验室又报道嗜热古菌 P.furiosus 的 Ago( PfAgo)也具有类似能力。Argonaute 蛋白家族在高等生物 RNAi 过程和表观遗传学过程中发挥重要作用,一直很热门,也正因此很早之前就有许多结构生物学家扑上去做结构。由于高等哺乳动物的 Ago 结构一时半会很难做完,就先搞出来了一堆低等生物的 Ago 结构,其中就有前面说过的 TtAgo 和 PfAgo,早就知道它们能结合 guide ssDNA,结构也很早就做清楚了,只是不知道后面居然还能有这种用处。以前 RNAi 热门,大家都去做切 RNA 的实验,现在 CRISPR 热门,大家都去做切 DNA 的实验。与这个逻辑类似的,2016 年四月 Doudna 组报道在某些 CRISPR 操纵子,比如细菌 M.piezophilla 的 CRISPR operon 里,并没有 Cas 核酸酶,但存在 Argonaute 编码序列。由于 Argonaute 是已知的携带 RNAseH 结构域,具有核酸酶活性的蛋白,他们猜想这个 Ago 可能跟本来应该在那的 Cas9 起的作用差不多。后来他们发现这个 MpAgo 是个使用 5 ’羟基化小 DNA 片段,对单链靶核酸(DNA/RNA)进行切割的奇怪的酶。所以结合 5 ’ p DNA 的 Ago 并不是一个全新的东西(十年前就知道),靶向 DNA 的 Ago 本身也不是一个全新的东西(两年前就知道)。

其实之前这些工作,在科学角度上来说都跟韩春雨等的工作意思比较接近了,但是问题是之前找到的 TtAgo, PfAgo,包括 Doudna 组报道的 MpAgo,来源都是嗜热菌,生境决定了它们只能在 65 摄氏度以上进行反应,无法应用到哺乳动物细胞系统。所以从工程上来说这些都是没有用的,需要应用的话一定要用工程手段。韩实验室的工作是很了不起的。他们很缺经费,这个看得出来。他们唯一的生物信息学工具可能是 NCBI-psiBLAST(只需要复制黏贴就能进行),他们的 Ago 都是从菌种库买来的菌里面克隆出来,根本没有花钱合成基因。就在这么艰难的工作环境下,他们用勇气和坚持,作出了令人钦佩的工作,不仅找到了 NBT 文章中报道的 NgAgo,还找到了一大堆别的 Ago,都具有在低温(10-50 摄氏度)下结合 5p-ssDNA,造成靶 DNA 双链断裂(DSB)的能力。NgAgo 切割靶 DNA 的效率,比 SpCas9 切割效率要高;NgAgo 脱靶的概率,比 SpCas9 低;而且 NgAgo 不需要 PAM motif 作为前置,这样设计切割位点的时候可以随便设计;NgAgo 的尺寸也不大,只有 2k 多一点,比 SpCas9 小。更重要的是,DNA-DNA duplex 的特异性远比 RNA-DNA duplex 高。他们工作本身是很扎实,结果也做得很漂亮。这个工作不但拓展了 Ago 的生物化学(之前没有过这样的用一条 guide ssDNA 就可以造成 DSB 的酶,而且 NgAgo 会随机的在切开以后去掉 1-20 个碱基),也拓展了 Ago 的生物学。比如藻类的 Ago 也有这样的能力,这是以前可能想不到的。

跟 CRISPR 系统类似,Ago 蛋白家族的进化也很复杂,不仅在真核有,在藻类,古菌和细菌里都有。真核的 Ago 来源是古菌,但是在更底层的物种里面,Ago 在各物种中跳来跳去,有很多横向转移。实际上,在这些宿主物种里,经常有 DNA 的横向转移。分子生物童工们都很熟悉的感受态,对于很多菌来说可能就是个常态。在这种生态环境下,寄生性的 DNA,比如转座子和病毒,对宿主制造的压力是很大的。具有横向转移能力的菌,也很容易通过横向转移来接收 Ago operons。这种情况下很容易进化出使用 5 ’ p ssDNA guide 的 site-directed nuclease,作为宿主天然免疫系统的一部分。事实上,TtAgo 最早发现的生物学意义就是使宿主能区分正常种内交配传来的 DNA 和未知来源的外源 DNA(2014 年 Swarts 等,Nature;2015 年 Blesa 等,J.Bacteriology)。所以我们可以期待很快发现更多具有类似能力或者更奇特能力的 Ago 蛋白,比如使用特殊的金属离子,使用特殊的 5 ’修饰结构,等等。甚至类似 Cas9,使用 RNA guide 来切 DNA,这些都是有可能的。有时候可能通过猜也能猜出点东西,比如看 Ago 结合核酸区域的电性,或者就直接看这个宿主菌的生境里面都有什么病原体,说不定都能有有趣的发现。

说实话这类工作的进步,首先有赖于基础微生物学和生态学的研究,其次依赖于小科学风格的经费支持。对于韩组来说最困难的时刻肯定是过去了,问题是还有多少有潜力的组没有被支持。至于说 NgAgo 能不能应用到转化领域,这几乎是一定的,因为基因编辑的市场太大。一定会有无穷多的人扑上来打结构,发文章,申请经费。现在即使不好用,修一下就会好的。何况既然细菌能进化出使用 5 ’ p ssDNA guide 的酶,就一定有一个生产 5 ’ p ssDNA 的办法,研究清楚就好说。 比如说吧,存在类似 piRNA biogenesis 里的 Ping-pong reaction 那样的 nickase-dependent DNA amplification 机制,是非常有可能的。

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